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本公司产品开发非洲马瘟病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒。


非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus，AHSV)会引起非洲马瘟，是一种马属动物的急性或亚急性传染病，该病以发热、皮下结缔组织与肺水肿以及内脏出血为特征，只能通过昆虫传播。马对此病的易感性最高，病死率高达95%。
本病发生有明显的季节性和地域性，多见于温热潮湿季节，常呈地方流行或暴发流行，传播迅速，因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
   
2. 根据非洲马瘟病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
   
3. 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10～100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
   
4. 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
   
5. 本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

组分	规格
2×qRT-PCR缓冲液	500μL
10×qRT-PCR酶混合液	100μL
ROX染料I，50×	20μL
ROX染料II，50×	20μL
荧光PCR专用模板稀释液	1mL
非洲马瘟病毒染料法qRT-PCR引物混合液	100μL
非洲马瘟病毒染料法qRT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	50μL

保存：-20℃，有效期一年。


一、稀释阳性对照(以10²～10⁷这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
   
2. 在7号管中加入5μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
3. 换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

5. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)
   再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
   
6. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取的核酸释放剂试用装，其使用手册可以从本公司网站www.bjbalb.com，通过搜索产品名称核酸释放剂或产品货号BTN61202下载。

三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

7. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
   
8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：
   

   成分	样品管 N+2个	qRT-PCR 阴性对照	qRT-PCR阳性对照 (2～7管)
   2×qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
   非洲马瘟病毒染料法qRT-PCR引物混合物	2μL	2μL	各2μL
   50×ROX(见注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
   样品制备所得RNA模板(来自于第8步)	5.6μL	-	-
   稀释所得6个阳性对照(来自于第6步)	-	-	各5.6μL
   超纯水	-	5.6μL	-
   10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

   注：
   
   9. 需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
      
   10. 需使用ROX染料II的机型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
       
   11. 不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
   
   
9. 上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
   

   过程	温度	时间
   RT(逆转录)	50℃	15～30min
   预变性	95℃	5min
   qRT-PCR反应 (40个循环)	95℃	15sec
   	58℃	1min(采集FAM通道的荧光信号)
   按仪器预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35～40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

相关搜索：非洲马瘟病毒(AHSV)荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)，African Horse Sickness Virus RT-qPCR Kit(SYBR)